CARACTERIZACIÓN ESPECTROSCÓPICA DE
BIOMOLÉCULAS
OBJETIVOS GENERALES
Se describirán distintas técnicas espectroscópicas de uso
habitual en Bioquímica y Biología, haciendo especial hincapié
en sus aplicaciones biológicas. El objetivo de la asignatura es
que el alumno conozca la aplicación de dichas técnicas y sepa
interpretar en términos biológicos los espectros obtenidos.
CRITERIOS DE EVALUACION
La evaluación se llevará a cabo mediante un examen escrito al
final del curso. Un tercio del examen corresponderá a evaluar la
comprensión de las bases teóricas de las técnicas explicadas.
El resto del examen se dedicará a la resolución de casos
prácticos (extracción de información bioquímica de espectros
proporcionados por el profesor) similares a los resueltos a lo
largo del curso. Se evaluará también el trabajo realizado en
clase de seminarios y la resolución de casos prácticos de cada
alumno.
PROGRAMA TEÓRICO
I.- FUNDAMENTOS DE ESPECTROSCOPIA
1.- Propiedades espectroscópicas. Radiación
electromagnética. Interacción Materia-Radiación. Niveles
energéticos moleculares. Espectro electromagnético. Principales
técnicas espectroscópicas.
II.- ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN
UV-VIS
2.- Fundamentos de la espectroscopia UV-Vis.
Regiones del espectro UV-Vis. Técnica experimental. Transiciones
electrónicas: Cromóforo. Intensidad de la absorción: Reglas de
Selección, Ley de Beer-Lambert. Desplazamiento de bandas de
absorción. Principales cromóforos. Aplicaciones de la técnica
UV-Vis. Análisis cuantitativo.
III.- DICROÍSMO CIRCULAR Y DISPERSIÓN
ÓPTICA ROTATORIA
3.- Propiedades quirópticas de las moléculas.
Polarimetría. Dispersión óptica rotatoria. Dicroismo circular.
Aplicaciones de la técnica de dicroismo circular: Reglas de
sector, "Exciton Coupling".
IV.- ESPECTROSCOPIA DE EMISIÓN
4.- Principios básicos de la Fluorescencia: procesos de
relajación. Espectros de fluorescencia. Factores que
influyen en la intensidad de la fluorescencia. Aplicaciones
prácticas. Medidas experimentales: espectrofluorímetros.
Corrección de espectros. Tiempos de vida y fluorescencia
resuelta. Sensibilidad de la fluorescencia al medio ambiente:
sondas fluorescentes. Procesos de transferencia de energía entre
cromóforos; determinación de distancias a través de la
eficiencia de la transferencia de energía. Polarización de la
fluorescencia.
V.- ESPECTROSCOPIA DE INFRARROJO.
ESPECTROSCOPIA DE RAMAN
5.- Vibraciones moleculares: Energía de vibración.
Regiones del espectro Infrarrojo. Instrumentación. Frecuencias
de grupo: análisis cualitativo de grupos funcionales.
Espectroscopia Raman.
VI.- TÉCNICAS DE RESONANCIA MAGNÉTICA
6.- Resonancia magnética nuclear: Fundamentos.
Técnica experimental. Desplazamiento químico. Acoplamiento
espín-espín. Efecto nuclear Overhauser. Principales técnicas
unidimensionales (1H-RMN y 13C-RMN) y bidimensionales (COSY,
NOESY, HETCOR).
7.- Resonancia paramagnética electrónica (RPE).
Fundamento teórico y similitudes con RMN. Características del
espectro. Medida de g. Interacción hiperfina. Interacción
hiperfina anisótropa. Anisotropía del espectro RPE.
Instrumentación. Técnicas de RPE avanzadas (ENDOR, ESEEM,
HYSCORE,...): investigación de un centro paramagnético en un
sistema biológico.
VII.- ESPECTROMETRIA DE MASAS
8.- Características generales. Métodos de
ionización. Métodos de análisis de iones. Aplicación a
biomoléculas.
VIII.- DISPERSIÓN Y DIFRACCIÓN
9.- Dispersión. Conceptos fundamentales.
Difracción de Rayos X. Medida experimental de la difracción:
Fuentes tradicionales y radiación sincrotrón. Condición de la
muestra. Sistemas de Detección.
PROGRAMA RESOLUCIÓN CASOS PRÁCTICOS
II.- ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN
UV-VIS
10.- Cromóforos naturales más habituales en sistemas
biológicos. El enlace peptídico: el ultravioleta
lejano de proteínas. Aminoácidos aromáticos: el ultravioleta
cercano de proteínas. Bases nitrogenadas: la absorción
dominante de los ácidos nucleicos. Grupos prostéticos
(flavinas, hemos, metales,...). Cofactores y coenzimas
(nucleótidos, ...).
11.- Aplicaciones biológicas de la espectroscopia UV-Vis.
Espectro UV-Vis como criterio de pureza y cuantificación de una
muestra biológica. Identificación de distintos componentes en
espectros de muestras biológicas. Cálculo de actividades
enzimáticas. Cálculo de constantes de equilibrio de formación
de complejos. Cálculo de potenciales de oxido-reducción de
proteínas.
12.- Tecnologías de uso habitual en Bioquímica y
Biología que emplean detectores de UV-Vis.
Cromatografías por HPLC y FPLC. Técnicas de cinética rápida:
fotolisis por pulso de láser, flujo detenido.
III.- DICROÍSMO CIRCULAR Y DISPERSIÓN
ÓPTICA ROTATORIA
13.- Cromóforos naturales más habituales en sistemas
biológicos. El enlace peptídico, aminoácidos
aromáticos, bases nitrogenadas, cofactores y grupos
prostéticos. Actividad óptica de proteínas: información sobre
su estructura secundaria. Actividad óptica de ácidos nucleicos.
14.- Aplicaciones biológicas del dicroísmo circular.
Identificación de distintos componentes en espectros CD de
muestras biológicas, asignación de estructuras secundarias.
Caracterización del estado de plegamiento de las proteínas.
Tecnologías de uso habitual en Bioquímica y Biología que
emplean detectores de dicroísmo circular. Técnicas de cinética
rápida: flujo detenido.
IV.- ESPECTROSCOPIA DE EMISIÓN
15.- Cromóforos naturales más habituales en sistemas
biológicos. Características fluorescentes de los
constituyentes de proteínas, ácidos nucleicos, grupos
prostéticos y cofactores: aminoácidos aromáticos, bases
nitrogenadas, flavinas, piridín nucleótidos.
16.- Aplicaciones biológicas de la espectroscopia de
emisión. Identificación de distintos componentes en
espectros de muestras biológicas. Cálculo de velocidades de
reacción y constantes de interacción mediante espectroscopia de
emisión. Caracterización del estado de plegamiento de las
proteínas. Empleo de sondas fluorescentes en el estudio de la
unión de ligandos y cambios conformacionales de estructuras
biológicas.
17.- Tecnologías de uso habitual en Bioquímica y
Biología que emplean detectores de emisión.
Cromatografías por HPLC y FPLC. Técnicas de cinética rápida:
flujo detenido.
V.- ESPECTROSCOPIA DE INFRARROJO.
ESPECTROSCOPIA DE RAMAN
18.- Aplicaciones biológicas. Espectros
vibracionales de biopolímeros. Principales bandas de absorción
características en un espectro IR del enlace peptídico.
Espectros de IR de polipéptidos y proteínas. Espectros de IR de
bases nitrogenadas y ácidos nucleicos. Espectros Raman de
polipéptidos, proteínas y ácidos nucleicos. Espectroscopia
Raman en el estudio de complejos proteína-ácidos nucleicos.
VI.- TÉCNICAS DE RESONANCIA MAGNÉTICA
19.- Aplicaciones biológicas de la RMN.
Preparación de la muestra. Aumento de la resolución.
Enriquecimiento con 2H, 13C y 15N. Estudios en azúcares.
Estudios metabólicos en tejidos intactos. Estudio de complejos
biológicos con sondas paramagnética. Empleo del RMN para
estudiar procesos en el tiempo.
20.- Aplicaciones a proteínas: RMN de protón en
proteínas. RMN de 13C de proteínas. Espectros COSY de
aminoácidos, asignación de secuencia y cálculo de estructuras
compatibles. RMN de ácidos nucleicos.
21.- Aplicaciones Biomédicas de la RPE.
Preparación de la muestra. RPE de radicales en sistemas
biológicos. Radicales estables (flavinas). Marcadores y sondas
de espín. Radicales inestables: utilización de atrapadores de
espín. RPE en el estudio de metaloproteínas. Proteínas que
contienen metales de transición. Proteínas sulfo-férricas.
Cálculo de potenciales redox. Aplicaciones de la RPE al estudio
del metabolismo de plantas: fotosíntesis. Membranas. La cadena
respiratoria mitocondrial. Estudios metabólicos en tejidos
intactos.
VII.- ESPECTROMETRIA DE MASAS
22.- Aplicación a biomoléculas.
VIII.- DISPERSIÓN Y DIFRACCIÓN
23.- Cristalografía de sistemas biológicos.
Redes cristalinas. Grupos espaciales compatibles con moléculas
biológicas. Toma e interpretación de datos. El mapa de densidad
electrónica: determinación y refinamiento de la estructura
molecular.
PRACTICAS
:
1.- Cálculo de una constante de disociación entre FNR y NADP+.
2.- Cálculo de la estabilidad conformacional de una proteína
(apoflavodoxina u otra comercial).
3.- Caracterización espectroscópica del estado de plegamiento
de una proteína.
BIBLIOGRAFIA:
* Physical Biochemistry. K. E. van Holde. (1985)
Prentice Hall, Enlgewood Cliffs, New Jersey.
* Biophysical Chemistry. Part II: Techniques for the
study of biological structure and function. C. R. Cantor
and P. R. Schimmel. (1980) W. H.
Freeman and Company. New York.
* Protein Structure: a practical approach. T. E.
Creighton. (1990) IRL Press at Oxford University Press, Oxford,
England.
* Cell and Molecular Biology: concepts and experiments.
G. Karp. (1996) J. Wiley and Sons, Inc. New York.