GENÉTICA MOLECULAR E INGENIERÍA
GENÉTICA
OBJETIVOS GENERALES
Conocimiento y comprensión de la tecnología del DNA recombinante y sus aplicaciones mas frecuentes.
CRITERIOS DE EVALUACION
Se llevará a cabo un examen teórico de la asignatura y se
realizará evaluación continua de las prácticas.
PROGRAMA TEÓRICO
- Desarrollo histórico de la genética molecular y la
ingeniería genética. Los orígenes de la genética
molecular. Desarrollo e impacto en la sociedad.
- Herramientas utilizadas en ingeniería genética.
Nucleasas. Endonucleasas de restricción. Modificación por
metilación. Enzimas de modificación: DNA polimerasas,
polinucleótido kinasa, DNA ligasa. Transcriptasas inversas.
PoliA polimerasa.
- Vectores de clonaje en sistemas procarióticos.
Plásmidos. Vectores derivados de bacteriófagos y virus.
Empaquetamiento. Cósmidos. Vectores lanzadera.
- Vectores de clonaje en sistemas eucarióticos.
Levaduras como huésped. Vectores autorreplicativos. Vectores
integrativos: disrrupción génica, reemplazamiento génico.
Vectores centroméricos. Vectores lineales. Cromosomas
artificiales (YAC´s). Vectores de clonaje en plantas: Sistemas
basados en el plásmido p-Ti. Vectores de clonaje en animales:
Vectores SV 40. Vectores basados en el virus del papiloma bovino.
Vectores basados en retrovirus.
- Adquisición de nuevos genes: Transformación,
conjugación y transducción en bacterias. Recombinación
sito-específica. Transposición. Transfección en plantas.
Transformación de células animales.
- Extracción y purificación de DNA cromosómico y
plasmídico. Técnicas de extracción de DNA
cromosómico. Aislamiento de plásmidos, cósmidos y fagos.
Purificación del recombinante. Análisis en geles de agarosa.
Electroforesis de campo pulsado.
- Hibridación de ácidos nucléicos: Técnicas
de Southern y Northern. "Dot blot". Polimorfismo de los
fragmentos de restricción (RFLP). Métodos de detección de DNA
y RNA hibridados.
- Estrategias de clonaje: Construcción de una
genoteca. Insertos de DNA genómico. Insertos sintéticos.
Insertos de c-DNA. Ligación vector-inserto: extremos cohexivos y
romos. Adición de "linkers" y adaptadores. Selección
de clones recombinantes.
- Caracterización del DNA recombinante: Tamaño
del inserto. Mapeo de sitios de restricción. Subclonación.
Localización de segmentos clonados en el genoma. Localización
cromosómica. Determinación del número de copias de una
molécula de DNA en el genoma.
- Amplificación enzimática de fragmentos de DNA y RNA.
Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Diseño de iniciadores ("primers") y síntesis de
oligonucleótidos. Variantes de la PCR. Aplicaciones.
- Técnicas de secuenciación del DNA.
Secuenciación enzimática y secuenciación química.
Secuenciación cíclica. Estrategias de secuenciación.
- Interacciones covalentes de los ácidos nucléicos con
pequeñas moléculas. Hidrólisis. Reacciones de
oxidación y de reducción. Reacciones con carcinógenos
activados metabólicamente. Reacciones con anticarcinógenos.
Modificación fotoquímica de los ácidos nucléicos. Efectos de
la radiación ioniozante. Consecuencias biológicas de la
alquilación del DNA.
- Interacciones reversibles de los ácidos nucléicos con
pequeñas moléculas. Interacciones electrostáticas
externas. Unión al surco (groove-binding). Intercalación.
Interacciones del RNA. Estructuras multihélice.
- Mutaciones. Clases de mutagénesis
fenotípicas. Mutagénesis a nivel molecular. Mutágenos.
Sistemas de reparación del DNA. Detección de mutaciones.
Mutagénesis dirigida: métodos y aplicaciones.
- Sistemas de expresión del DNA recombinante. Transcripción
y traducción in vitro. Determinación de puntos de inicio y
terminación de la transcripción. Sistemas de expresión de
proteínas recombinantes in vivo. Detección de los productos de
expresión. Análisis de Western. Fusiones a genes informadores
(reporter genes) para el análisis de promotores. Optimización
de la expresión de proteínas recombinantes.
- Purificación de proteínas sobreexpresadas.
Factores que influyen en las propiedades físicas de las
proteínas sobreexpresadas en células de E. coli. Purificación
de proteínas a partir de cuerpos de inclusión. Procesamiento de
las proteínas de fusión. Purificación de proteínas que se
unen específicamente con ácidos nucléicos: Análisis de la
unión de fragmentos clonados y proteínas: Ensayos de
protección y modificación. "South-western blot".
Métodos de ensayo de la unión DNA-proteína "in
vivo". Aplicaciones de la sobreexpresión de proteínas
recombinantes (2 horas)
- Interacciones proteína-ácidos nucléicos:
herramientas de estudio. Proteínas reguladoras que se
unen a DNA. Motivos estructurales. Elementos reguladores en el
DNA. Secuencias de reconocimiento. Interacciones RNA-proteína.
Metodología de estudio: Métodos de resolución. Estrategias de
purificación. (2 HORAS)
- Ordenadores y Biología Molecular Bases de
datos de secuencias de ácidos nucléicos y proteínas.
Ensamblaje de secuencias de DNA. Análisis de secuencias de DNA.
Predicción de los niveles de expresión a través de la
secuencia de nucleótidos. Apoyos informáticos para el análisis
de secuencias de proteínas.(1 hora)
- Ingeniería genética y sociedad. Aspectos
legales y éticos.
PRACTICAS
DE ORDENADOR
- Elaboración de un mapa de restricción
- Diseño de oligonucleótidos para clonaje, secuenciación y
mutagénesis
- Identificación de secuencias específicas de DNA: secuencias
consenso en promotores y terminadores de la transcripción.
- Búsqueda de homologías en DNA y proteínas
PRACTICAS
DE LABORATORIO:
- Aislamiento de plásmidos
- Digestión y elaboración del mapa de restricción.
Determinación de RFLP
- Conjugación
- Titulación de la infeccción causada por un bacteriófago.
BIBLIOGRAFIA:
- Biología Molecular: Avances y técnicas generales.
Ed. Universidade da Coruña. 1997.
- Recombinant DNA and Biotechnology. A guide for
students. H. Kreuzer and Adrianne Massey. American Society for
Microbiology
(ASM press) 1996.
- Genes VI. Lewin. Oxford University Press.
1997.
- PCR Technology: principles and applications for DNA
amplification. Henry A. Erlich ed. stockton press.
- DNA cloning 2: A practical approach.
Expression systems. Glover and Hames eds. IRL Press.