METOLOGÍA BIOQUÍMICA II
PROGRAMA
I.- LIPIDOS (10 Sesiones)
Sesión 1.-
a) Introducción teórica a las técnicas de análisis de
Lípidos.
b) Inicio de los cultivos celulares.
Sesión 2.-
a) Delipidar Albúmina bovina (o SFB) y acomplejarla con
distintos ácidos grasos.
b) Suplementación de los cultivos con los complejos Alb (o
SFB)-Acidos grasos. (Cultivo de 48 horas)
Sesión 3.-
a) Aislamiento de Lipoproteínas a partir de muestras de plasma
(HDL por precipitación).
b) Determinación de colesterol total en plasma y en la fracción
de HDL (método químico).
Sesión 4.-
a) Determinación de colesterol libre y/o triglicéridos en
plasma (métodos enzimáticos).
b) Preparación de placas para cromatografía en capa fina.
Sesión 5.-
a) Recolección de células: cultivos suplementados y control.
b) Extracción de lípidos de los cultivos celulares (y otras
muestras: hígado, cerebro, leche, frutos secos........).
Sesión 6.-
a) Cromatografía en capa fina de los extractos lipídicos:
separación de lípidos neutros.
b) Cromatografía en capa fina de los extractos lipídicos:
separación de fosfolípidos.
Sesión 7.-
a) Preparación y purificación de ésteres metílicos.
Sesiones 8 y 9.-
a) Cromatografía de gases.
b) Cromatografía en capa fina de argentación.
Sesión 10.- Análisis de los resultados
obtenidos.
II.-ACIDOS NUCLEICOS (10 Sesiones)
Sobreexpresión de la flavodoxina de Anabaena en E. coli.
y amplificación por PCR del gen fur.
1.- Introducción al laboratorio de biología molecular.
Preparación de placas de LB-agar. Transformación de E. coli con
un plásmido de expresión conteniendo el gen de la flavodoxina.
2.- Ver resultados transformación. Preparación de geles de
agarosa para separar fragmentos de DNA. Preparación de cultivos
para aislamiento de plásmido.
3.- Aislamiento del plásmido (método de hervido). Análisis
mediante electroforesis en agarosa-bromuro de etidio y
cuantificación del plásmido obtenido.
4.- Digestión del plásmido. Cálculo del peso molecular del
vector y del inserto. Preparación de los medios de cultivo e
inoculación para práctica 5.
5.- Preparación del cultivo para sobreexpresar flavodoxina.
Inducción. Toma de muestras. Preparación de un gel de PAGE-SDS
para visualizar la expresión de flavodoxina recombinante.
6.- Electroforesis de las muestras sobrexpresando flavodoxina a
diferentes tiempos de inducción. Transferencia de Western.
7.- Revelado del Western. Interpretación de los resultados.
8.- Amplificación por PCR del gen fur (ferric uptake
repression). Preparación del gel de agarosa-bromuro de etidio
para visualizar el resultado.
9.- Purificación del producto de amplificación
(freeze-squeeze).
10.- Electroforesis del inserto purificado. Estrategias de
secuenciación. Lectura de una autorradiografia.